# 参数设置

LING ld

登录进入CASdesign网站，在物种列表页，首先进行如下操作：

选择一个感兴趣的基因组
在选择位置弹出框中选择目标编辑位点
在弹框下方，设置使用CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1基因编辑工具后，点击参数设置可对更多参数进行适当调整。

各参数的详细解释见下文。

# 1. General

# 1）目标区域可视化侧翼链长度

如上图所示，此参数定义了可视化交互编辑界面中，在目标位点（蓝色区域）两侧要额外显示的序列长度（橙色区域）。此参数是为了在交互编辑的时候，允许用户选择目标位点以外的区域进行基因敲除、基因插入/替换操作。

默认值

1000 bp

**注意：**设置长度应考虑染色体长度的边界，保证目标位点两侧有足够长度的区域。

# 2）编辑区同源左、右臂长度

同源修复的左、右同源臂是发生同源双交换引入外源片段时必须的片段，是为了在引入外源片段时细胞发生同源重组修复过程中可以精准定位到特定位置并引入外源片段的引导者片段。它是在进行基因敲除/替换具体编辑操作的时候，敲除/替换区两侧的指定区间，需要根据该指定的同源区长度进行编辑区同源左右臂引物的计算。

如图所示的黑色线段表示引物：

HoL-F: 同源左臂forward引物；
HoL-R: 同源左臂reverse引物；
HoR-F: 同源右臂forward引物；
HoR-R: 同源右臂reverse引物。

默认值

1000 bp

**注意：**设置长度应考虑染色体长度的边界，保证编辑区域两侧有足够长度的同源左、右臂。

# 3）gRNA序列GC含量

设置gRNA序列GC含量（%）范围，筛选符合的gRNA。

默认值

最小GC(%)含量：20%

最大GC(%)含量：80%

# 4）gRNA self-complementary

CHOPCHOP算法中考虑了Thyme等人的self-complementarity score研究，该方法计算了sgRNA内以及sgRNA与骨架之间潜在的4 bp茎数。因此，用户可以使用该选项选择避免具有自身互补性的sgRNA。

默认值

-1 (no filter)

# 2. Cas9 or Cpf1

根据用户选择的不同CRISPR效应蛋白（Cas9或Cpf1），用户可对应分别设置：

1. sgRNA长度：Cas9模式下默认长度为20 bp，Cpf1模式下默认长度为24 bp；
1. PAM序列：Cas9模式下默认的PAM序列为NGG，Cpf1模式下默认是PAM序列为TTCN；
1. gRNA效率算法（详情见下文）：Cas9模式下默认算法是Doench et al. 2016 - only for NGG PAM，Cpf1模式下默认算法是Kim et al. 2018；
1. gRNA载体引物（详情见下文）：页面上默认提供的是基于CRISPR/Cas9的p426_Cas9_gRNA-ARS106a载体。

# 1）效率算法

CRISPR sgRNA可以按2个标准进行排名：

1. 效率：特定sgRNA促进切割的可能性;
1. 特异性：sgRNA结合脱靶位点的可能性。

根据实验研究，CHOPCHOP的初始版本提供了两个简单的效率指标:

1. sgRNA的GC含量（理想的是介于40％和80％之间）；
1. sgRNA是否在位置20处含有G。

自从CHOPCHOP发布以来，针对不同编辑模式下的gRNA效率评分已发展了越来越多的算法模型。使用这些方法，CHOPCHOP可以使用特定算法对每个sgRNA进行评分，在结果中，该分数被报告为“效率分数（Efficiency Score）”。

# 2）自定义gRNA引物片段

在实验中，gRNA片段需要插入合适的载体骨架中以构建CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1表达载体，根据gRNA在载体中的插入位置指定gRNA上下游长50bp的片段，以在结果页输出一对gRNA引物。

如下图所示：

若gRNA在载体中的插入位置在gRNA-scafold上游;
在参数设置中指定gRNA上（Forward）下（Reverse）游长50bp的片段（图中白色标注的区域）；
Forward为正义链（Top Strand）5'->3'片段；
Reverse为负义链（Bottom Strand）5'->3'片段；
根据该参数设置，最终在结果页会输出紫色区域示意的gRNA引物对。

注意！！！

需要根据您实际使用的载体骨架更改上述两个片段具体序列；

网页默认设置的两个片段来自p426_Cas9_gRNA-ARS106a载体，它是基于CRISPR/Cas9对酵母进行基因编辑时常用的pCut载体工具之一。

pCut质粒工具包可以从Addgene获取。

# 3. Primers

# 1）敲除引物参数设置

以酵母中GAL80基因的敲除为例。通过敲除GAL80基因，可使酵母内半乳糖诱导表达的高活性启动子成为组成型表达，活性也可保持在较高水平，这样使酿酒酵母在利用较廉价的葡萄糖同时也可保持较高的异源蛋白表达水平。页面上具体操作为：

选择sacCer3_S288C基因组，点击基因编辑；
在选择位置弹框中搜索GAL80（或自定义靶向位点为第13号染色体，起始位点171594，终止位点172901，序列方向正）；
点击参数设置，进入到primer设置的Tab页，根据需要调整敲除引物设置；

1. 敲除的引物名为编辑位点名-repair-F和编辑位点名-repair-R。其中，F和R分别表示Forward和Reverse；
1. 默认单条引物总长为88 bp（如图，黑色线段表示的片段，可通过product size更改）；
1. 引物对互补的区域取编辑位置后20-28 bp序列内（如图，灰色方框内区域，可通过primer size更改）Tm在55-60度（可通过primer TM更改）之间的序列（如不能达到该要求，直接取编辑区域后25 bp序列）。

# 2）插入片段引物参数设置

以酵母中GAL80基因的整合设计为例。在GAL80位置处插入5个片段，可以组成用半乳糖启动子P_GAL1、P_GAL10表达crtI和crtYB基因的表达元件。

将该表达元件直接替换到GAL80基因的位置上，一方面可以将酿酒酵母内半乳糖诱导型启动子直接变为组成型启动子，使P_GAL1、P_GAL10在较廉价的葡萄糖内也可以保持高表达。另一方面，在酿酒酵母内直接添加了两个异源基因crtI和crtYB，使酿酒酵母获得可以生产胡萝卜素的能力。页面上具体操作为：

选择sacCer3_S288C基因组，点击基因编辑；
在选择位置弹框中搜索GAL80（或自定义靶向位点为第13号染色体，起始位点171594，终止位点172901，序列方向正）；
点击参数设置，进入到primer设置的Tab页，根据需要调整插入片段引物设置（具体参数解释见下）；

插入/替换引物参数详解

1. 结果页中，插入/替换的引物名为：编辑位点名-HoL/R-F/R，Frag1-F/R，Frag2-F/R……Frag(n)-F/R。其中，n为用户输入的片段数；
1. HoL，同源左臂：默认取选定的区域前1000个序列（由General下编辑区同源左臂长度控制）。HoL-F为开始的30 bp内（可通过primer size更改）Tm在55-60度（可通过primer TM更改）的序列（如不能达到该要求，直接取后25个序列），HoL-R为结束的30 bp内Tm在55-60度的序列（如不能达到该要求，直接取后25个序列） +片段1前60 bp（可通过size overhang in next insert更改）；
1. HoR，同源右臂：默认取选定的区域后1000个序列（由General下编辑区同源右臂长度控制）。HoR-F为片段n的最后60 bp+开始的30 bp内Tm在55-60度的序列（如不能达到该要求，直接取后25个序列）序列，HoR-R为结束的30 bp内Tm在55-60度的序列；
1. 片段1：Frag1-F为开始的30 bp内Tm在55-60度的序列，Frag1-R为结束的30 bp内Tm在55-60度的序列（如不能达到该要求，直接取后25个序列） +片段2前60 bp；
1. 片段2：Frag2-F为开始的30 bp内Tm在55-60度的序列，Frag2-R为结束的30 bp内Tm在55-60度的序列（如不能达到该要求，直接取后25个序列） +片段3前60 bp；
1. 片段3：Frag3-F为开始的30 bp内Tm在55-60度的序列，Frag3-R为结束的30 bp内Tm在55-60度的序列（如不能达到该要求，直接取后25个序列） +片段4前60 bp；
1. 片段4：Frag4-F为开始的30 bp内Tm在55-60度的序列，Frag4-R为结束的30 bp内Tm在55-60度的序列；
1. …………
1. 如此类推，最后一个片段的规则为取开始的30 bp内Tm在55-60度的序列为F，结束的30 bp内Tm在55-60度的序列为R。

进入序列可视化页面后，选中GAL80区域，点击插入/替换按钮，将准备好的5条插入片段粘贴到输入框中（注意序列方向应该均为5'->3'）。

CGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTATTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGCATGAGGTCGCTCTTATTGACCACACCTCTACCGG

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在下图所示的弹框中设置，用户可以进行片段顺序调整、选择是否将序列插入负义链、删除多余插入框等操作。设置好插入序列后，点击“确定”回到编辑页面。

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