# 基因敲除实验流程

# 一、引物订购

🛒订购以下两段引物：

# 二、PCR获得线性化pCUT骨架

1）第一步： 准备PCR反应体系

2）第二步： 进行如下PCR反应

步骤	温度（°C）	时间	备注
1	95	3min
2	95	15s	35个循环
3	52	15s
4	72	3min
5	72	5min
6	16	∞

3）第三步： PCR反应结束后，直接在PCR反应体系中加入1μL的DpnI限制性内切酶（NEB）在37摄氏度下消化30-60分钟

4）第四步： 消化结束后，使用1%的琼脂糖核酸凝胶进行电泳验证

5）第五步： 验证线性化骨架大小正确后，直接进行PCR产物纯化，浓度测定，线性化骨架片段待用

# 三、构建双链gRNA片段

1）第一步： 使用CASDesign进行gRNA引物设计

2）第二步： 把gRNA引物稀释到终浓度为10μM的工作浓度

3）第三步： 准备PCR反应体系

4）第四步： 进行如下PCR反应

5）第五步： PCR完成后进行产物纯化，测定浓度，该gRNA片段待用

# 四、构建修复DNA片段

第一步： 使用CASDesign进行修复DNA片段引物设计

第二步： 如步骤3，构建修复DNA片段

# 五、酿酒酵母转化

第一步： 酵母过夜活化后转接至约50 mL YPD培养基中，初始OD调节至约为0.2

第二步： 30℃ 220rpm培养至OD在0.6-1.0之间

第三步： 将菌液转入无菌离心管中，3000rpm离心5min后弃去YPD培养基

第四步： 重悬于40mL无菌水中，3000rpm离心5min后去上清

第五步： 重悬细胞于10mL 0.1M LiAc中，用微量移液器轻轻混匀，3000rpm离心5min后去上清

第六步： 重悬细胞于400 uL的0.1M LiAc中，轻轻混匀

第七步： 吸取50uL样品加到标记的无菌离心管中，5000rpm，离心60s

第八步： 去除LiAc， 加入240μL 50% PEG3350，混匀后加入36μL 1M LiAc，加入5μL 10mg/mL单链鱼精DNA（100℃煮沸5min后迅速置于冰上）

第九步： 加入步骤3中的gRNA片段DNA（0.1-10ug），步骤4中的修复DNA片段（0.1-10ug），步骤2中的线性化pCUT骨架（约300-500ng），最后加入无菌水至体积为70μL

第十步： 混匀，置30℃保温30 min，置42℃热击25min

第十一步： 5000rpm，60s离心，除去转化液，重悬细胞于1mL无菌水

第十二步： 离心去上清，加入无菌水，涂布在与所用pCUT线性化骨架相应营养缺陷型平板上