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基因插入/替换实验流程
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一、引物订购
🛒订购以下两段引物：
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二、PCR获得线性化pCUT骨架
1）第一步： 准备PCR反应体系
备注：
pCUT模版可以为任意一个现有的pCUT载体
2）第二步： 进行如下PCR反应
3）第三步： PCR反应结束后，直接在PCR反应体系中加入1μL的DpnI限 制性内切酶（NEB）在37摄氏度下消化30-60分钟
4）第四步： 消化结束后，使用1%的琼脂糖核酸凝胶进行电泳验证
5）第五步： 验证线性化骨架大小正确后，直接进行PCR产物纯化，浓度测定，线性化骨架片段待用
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三、构建双链gRNA片段
1）第一步： 使用CASDesign进行gRNA引物设计
2）第二步： 把gRNA引物稀释到终浓度为10μM的工作浓度
3）第三步： 准备PCR反应体系
4）第四步： 进行如下PCR反应
5）第五步： PCR完成后进行产物纯化，测定浓度，该gRNA片段待用
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四、构建插入/替换DNA片段
1）第一步： 使用CASDesign进行插入/替换DNA片段引物设计，得到的引物序列为Frag1-F/R、Frag2-F/R、Frag3-F/R……如此进行匹配使用
2）第二步： 每插入一个片段即使用Frag(n)-F/R作为上下游引物，准备PCR反应体系
备注：
如：需要插入5个片段，则需要准备5个PCR反应体系
3）第三步： 进行如下PCR反应
4）第四步： PCR反应结束后，直接在PCR反应体系中加入1μL的DpnI限制性内切酶（NEB）在37摄氏度下消化30-60分钟
5）第五步： 消化结束后，使用1%的琼脂糖核酸凝胶进行电泳验证
6）第六步： 验证片段大小正确后，直接进行PCR产物纯化，浓度测定，最终即可获得待用的插入/替换DNA片段1、2、3等
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五、上下游同源臂DNA片段
1）第一步： 根据所选需要编辑的序列，合成结果页面提供的gene-HoL-F/R、gene-HoR-F/R这4段引物，稀释成10μM工作浓度
2）第二步： 准备PCR反应体系
备注：
1）HoR方向的同源臂同样方式准备反应体系
2）模版为需要转化的底盘菌株，取100μL菌液，5000rpm离心1min后加入50μL 20mM NaOH混匀，100摄氏度沸水浴20min后马上放冰上5min的菌裂解液
3）第三步： 进行如下PCR反应
4）第四步： PCR反应结束后，使用1%的琼脂糖核酸凝胶进行电泳验证
5）第无步： 验证片段大小正确后，直接进行PCR产物纯化，浓度测定，两段同源臂DNA片段待用
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六、酿酒酵母转化
1）第一步： 酵母过夜活化后转接至约50 mL YPD培养基中，初始OD调节至约为0.2
2）第二步： 30℃ 220rpm培养至OD在0.6-1.0之间
3）第三步： 将菌液转入无菌离心管中，3000rpm离心5min后弃去YPD培养基
4）第四步： 重悬于40mL无菌水中，3000rpm离心5min后去上清
5）第五步： 重悬细胞于10mL 0.1M LiAc中，用微量移液器轻轻混匀，3000rpm离心5min后去上清
6）第六步： 重悬细胞于400 uL的0.1M LiAc中，轻轻混匀
7）第七步： 吸取50uL样品加到标记的无菌离心管中，5000rpm，离心60s
8）第八步： 去除LiAc， 加入240μL 50% PEG3350，混匀后加入36μL 1M LiAc，加入5μL 10mg/mL单链鱼精DNA（100℃煮沸5min后迅速置于冰上）
9）第九步： 加入步骤3中的gRNA片段DNA（0.1-10ug），步骤4中的插入/修复DNA片段（0.1-10ug，如：需要插入5个片段即加入5个DNA片段），步骤2中的线性化pCUT骨架（约300-500ng），步骤5中的两个同源臂片段，最后加入无菌水至体积为70μL
10）第十步： 混匀，置30℃保温30 min，置42℃热击25min
11）第十一步： 5000rpm，60s离心，除去转化液，重悬细胞于1mL无菌水
12）第十二步： 离心去上清，加入无菌水，涂布在与所用pCUT线性化骨架相应营养缺陷型平板上